人脐带单核细胞

人脐带单核细胞需要准备好细胞所要用到的培养基和相关试剂，虽然所有的贴壁，半贴壁或者悬浮细胞处理方式差不多，但是不同的实验室培养条件和处理力度还有试剂的批间差这些问题存在，也会导致对细胞处理不当，  或者环境的不适应而造成细胞的死亡。
人脐带单核细胞培养物的生理环境不同时定义为其物理化学环境中，更好地理解血清的组件，所必需的增殖的生长因子的鉴定，并更好地理解细胞在培养的微环境（即，细胞 - 细胞相互作用，气体的扩散，与基质相互作用）现在允许在无血清培养基中某些细胞系的培养。
培养物的主要优点是操纵物理化学（即，温度，pH，渗透压，O2和CO2张力）和生理环境（即，激素和营养物浓度），其中所述细胞繁殖的能力。除温度，将培养环境是由生长培养基进行控制。
对于培养，只要我们细心操作，注意细节，并不是大家说的那样困难。对于有经验和有条件的客户，建议由公司代为培养细胞及进行后续研究。

细胞复苏技术：

1. 取出细胞，迅速放入37℃温水中快速解冻

2. 吸出细胞悬液,并加10倍以上培养液

3. 1000r/分钟离心5分钟，去除上清

4. 用培养液适当稀释后接种培养瓶,放入37℃ CO2培养箱静置培养

5. 镜检细胞贴壁能力，次日更换一次培养液,继续培养

培养方法：

收到细胞后，在倒置显微镜下观察整个细胞生长情况：

如果细胞未长满，用75%酒精喷洒整个瓶消毒后放到超菌台内，严格无菌操作，打开细胞培养瓶，留10ml培养液继续培养。

如果细胞已长满（达80-90%）。即可进行传代，具体步骤如下：

a，弃去培养液，用PBS洗1-2次。

b，向瓶内加入1.0-2.0ml酶液，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆，迅速拿回操作台，吸取酶，加含有6ml 含10%血清的培养液，轻轻吹打细胞。

c，加入等量的的培养液，轻轻吹打混匀后吸出一半，分到新的培养

d，传代比例：1:2-1:3

保存和应用：

客户可以根据自己的需求选择新鲜或者冻存的原代细胞，如是新鲜原代细胞，客户收到细胞后应立即将其放入CO2细胞培养箱内静置后2-3h，再进行后续的实验操作。如是冻存细胞，客户收到细胞后应立即将其放入液氮、-80℃冰箱或立即进行复苏。

细胞复苏的原则：

在实际操作中，冻存细胞要进行复苏，再培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。

1）该细胞只能用于科研，不得用于临床。

2）收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。

3）仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。

4）用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题贴壁细胞会有少量从瓶壁脱落，将细胞置于培养箱内静置培养过夜，隔天再取出观察。此时多数细胞均会贴壁，若细胞仍不能贴壁请用台盼蓝染色测定细胞活力，如果证实细胞活力正常，请将细胞离心后用新鲜培养基再次贴壁培养；如果染色结果显示细胞无活力，请拍下照片及时和我们联系，信息确认后我们为您再免费寄送一次。

5）请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议直接购买我司提供的培养基。

6）建议客户收到细胞后qian3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。

细胞培养操作

1）复苏细胞：将含有1 mL细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1-2 min（视细胞情况而定），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加2-3ml培养基终止消化。轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心5 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

c、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为例；

a、收集细胞，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

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